主要受溶剂、pH影响，另外温度、浓度等也有一定影响。
二氯荧光素有开环、闭环两种异构体，其中闭环异构体没有荧光，而内酯环打开的异构体有荧光。
一般来说，随着溶剂极性的增加，二氯荧光素的发光呈增强的趋势。
pH对二氯荧光素的发光有巨大的影响。在强酸性条件下，二氯荧光素的内酯环是闭合的，几乎没有荧光，同时其在水中的溶解度也很小。在中性条件下，部分内酯环可以打开，荧光显著增强。在碱性条件下，羟基会形成钠盐、内酯环开环，荧光大幅增加。随着pH增大到一定程度，荧光强度趋于饱和。
二氯荧光素的量子产率和发光强度在一定范围内通常随着温度的增加而减小，温度越低发光越强。
另外荧光素浓度的大小对量子效率也有影响，浓度太大的时候会产生自淬灭效应，减弱量子效率。
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