土壤中石油污染物微生态修复原位试验研究

一、试验点的选择

野外试验的场地选择在陕西省延安市安塞县建华寺乡孟新庄延长采油公司杏2采油场，该井场水电畅通，并且有闲置厂房，属于延长石油公司杏子川采油区，距安塞县城30km(图6-9)。

图6-9 安塞杏子川杏2采油场位置图☆为杏2井位置

在试验过程中，水源是必需之物，一方面试验土层中要不断加入水，以便达到试验要求的最低含水量;另一方面测试样品时，需要水来稀释样品、刷洗器皿等。同时，试验中需要测试的土壤样品数庞大，若带回室内测试，不仅费时费工，而且需要运输，增加了试验的错误几率。本次试验进行了52d，试验场地需要长期的严格管理。

杏2井能满足上述条件，试验过程便于管理，省时省力。另外，该井场的采油井正在开采，便于试验原油的获取。

二、试验设计

1.优化菌群制剂的准备

首先将室内培养的菌群进行逐级放大培养，接种量按10%接种培养，降解石油细菌的富集组合培养基:

K₂HPO₄(1.0g)，KH₂PO₄(1.0g)，MgSO₄·7H₂O(0.5g)，NH₄NO₃(1.0g)，可溶性淀粉(10.0g)，CaCl₂(0.02g)，FeCl₃(微量)，蔗糖(2g)，石油(1%～5%)，水(1000mL)，pH值(7.0)。121℃灭菌30min备用。

将需放大培养的菌液制剂按比例培养足够量，每次放大培养需要5～8d。最后在要出野外之前将培养好的菌液制剂存放于刷洗干净的25L大塑料桶，根据需要和可能用的量准备了3大桶，共计75L。在出野外前对大桶菌液进行显微镜检测，看菌群的生长及数量是否丰富。

2.实验器材

化学试剂:MgSO₄·7H₂O，NH₄NO₃，CaCl₂，FeCl₃，KH₂PO₄，K₂HPO₄，KCl，盐酸、酒石酸钾钠、石油醚、三氯甲烷等均为分析纯。

实验用石油为试验场地下2400m采出的原油。

实验用玻璃器皿等:150mL，250mL具塞三角瓶，125mL，1000mL磨口细口试剂瓶，50mL，25mL比色管50支一套各一套、橡胶塞、25L塑料桶，等等。

主要仪器:QZD-1型电磁振荡器、KQ218超声波清洗器、生物恒温培养箱、高速离心机、高压蒸汽灭菌器、无菌实验室、生化培养箱、摇床培养箱、莱卡生物显微镜、752N紫外可见光栅分光光度计、pHB-3型pH计、DDB-303A型电导率仪、电热干燥箱及各种化学分析用玻璃仪器。

3.测试方法

石油烃含量和NO^－₃含量采用德方提供的超声波-紫外分光光度法，NH⁺₄含量采用纳氏试剂比色法、pH值直接使用pHB-3型pH计，TDS用DDB-303A型电导率仪测得电导率换算得出。

4.试验小区的整理和基本物理参数的测试

试验前先对试验小区进行平整，将表层腐殖质层挖去，然后将分成8个试验小区:试验1区、试验2区、试验3区、试验4区、试验5区、试验6区、对照区、空白区等。各小区大小为120cm×120cm，各小区相间20cm，试验设计深度0～15cm，最后至50cm，小区由西向东排列，见试验区分布示意图6-10。

各试验区基本数据的采取:先将试验区表层人为填土除去以出露原地层土壤，原土壤岩性为黄土土壤，土中含有少量2～10mm的小砾石或小姜石，土壤湿容重为1.821g/cm³;自然含水量为9.18%;pH值为8.4;硝酸盐含量为55.3mg/kg;铵含量为8.85mg/kg;土壤本底石油含量为1.3～4.6mg/kg。

试验区土层重量的计算:120cm×120cm×15cm×1.82g/cm³=393120g=393.12kg。

5.试验步骤

因在试验阶段未能找到合适的石油污染场地，作为试验研究则选择了人为添加污染源的试验方法。原油的施加方法:将当地杏2井采出的原油脱水后，称取800g，用500mL分析纯石油醚稀释，均匀喷入试验区，每个试验区均加入基本相当的石油量。但每个区的石油含量不一定相同，只是大体差不多，以每区测试数据为准。

将均匀喷入原油的各试验区的试验土层，经多次翻动使加入的石油均匀混入试验层中。而后将各试验区准备好的试验添加材料逐个加入，1号试区的添加剂为粉碎的鲜茅草。2号试区为鸡粪与鸡粪土(各50%)。3号试区为谷糠、黍糠。4号试区为麦麸。5号试区除加原油外，接种菌液制剂和营养液。6号试区与5号试区相同，只不过是与1～4号一样均加盖农用塑料薄膜用于保温、保湿、防雨等。对照区仅加入原油，其他不加。空白区不加任何材料，仅作空白监测。上述试区加入添加剂后继续翻动试验土层使之土层混合均匀。

图6-10 陕西安塞杏子川杏2采油场试验区示意图

将培养好的菌液制剂，按各试区试验土层重的3%接种量接入，混合均匀。配制营养液，营养液的主要成分:MgSO₄·7H₂O，NH₄NO₃，CaCl₂，FeCl₃，KH₂PO₄，K₂HPO₄。配制比例以培养基成分配比为基准。

在上述准备好的试验区加入配制好的营养液30L，试验用水为当地浅层地下水，pH值为8.2，TDS含量为420.5mg/L。再加入约5L的地下水，使试验区试验土层含水量大概保持在20%以上(含水量的计算:菌液按3%计为约12kg，营养液30L，5L地下水，原土壤含水量为9.18%，共计含水量约为20.93%)。在试验区覆盖塑料薄膜用于保温、保湿、防雨等。在一定时间间隔取样，取样方法是在各区以梅花状取5个不同点的同一深度土样，而后充分混合后4分法取样测试。取样后翻耕试验区试验层使其暴气充氧，并补充一定水量保证试验土壤含水量在20%左右。对照区加入与试验区相同的石油量，其他不加，作为自然降解。空白区不加任何物质作为监控样品。各区同时取样测试，测试成分为石油量，pH值，土壤易溶盐，含水率，NH⁺₄，NO^－₃，等等。并同时监测地表及试验土壤温度。试验期完成后分别对各区试验层下部分层取样。

三、试验区试验过程及结果

(一)第1试验区

在上述试验区准备的基础上，按试验区试验层土壤重1.4%的比例混入剁碎长为1～3cm的鲜茅草，作为添加剂。随后将试验区土壤翻耕均匀，按培养基成分比例调控氮、磷、钙、镁、硫、铁等营养元素，用当地地下水控制试验土层含水量在20%左右。在试验区覆盖塑料薄膜用于保温、保湿、防雨等。一定时间间隔取样，取样方法是在该区以梅花状取5个不同点的同一深度(15cm)土样，而后充分混合后4分法取样测试。测试结果见表6-16～6-19，图6-11。

表6-16 试验1区与对照、空白区土壤中石油含量随时间变化测试结果

表6-17 试验1区土壤pH值，含水率(w)与TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随时间变化测试结果

表6-18 试验后1区下部土壤中石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随深度变化测试结果石油含量TDS含量NH⁺含量NO^－含

表6-19 试2区土壤中石油含量随时间变化测试结果

注:石油去除率计算以0～7d的平均石油含量为初始浓度(2318.5mg/kg)计算;第3天的数据代表性差略去。

图6-11 试1区土壤中石油随时间的去除率

1.微生态修复土壤中石油的去除率

由表6-16和图6-11可知:通过野外现场实验，得出微生态技术在土壤石油污染修复中是具有一定实效性的。试验区在试验初期0～7d加入的优化菌液并没有发挥作用，也就是说室内优化的菌液应用于野外时，经过了一个适应期或是细菌的延滞期(lag phase)，本试验区适应期在7d左右。而后进入增殖期也是对数期(logarithmic phase)。图6-11显示在试验的第11天即适应期后5d去除率为40%以上，试验至32d时则去除率达80.32%。而对照区土壤的石油含量变化不大(除去两个异常低值基本在10%以内)，说明自然条件下，土壤中石油降解是缓慢的。空白区反映了在没有加任何物质情况下土壤中的石油含量，但在试验后期可能是由于试验区和对照区与空白区相邻又加之降雨和人为取样活动污染了该区，造成含量有所增加。

2.土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量分析

环境的pH值对微生物的生命活动有一定影响，它可引起细胞膜电荷的变化以及微生物体内酶的活性改变，从而影响微生物对营养物质的正常吸收。非正常的pH值使环境中营养物质的可利用性和有害物质的毒性改变。每一种微生物的生存都有一定的pH值范围和最适pH值。大多数细菌的最适pH值为6.5～7.5，放线菌pH值为7.5～8.0，真菌可以在广泛pH值范围内生长发育，如pH值在3以下或9以上仍能生长，而最适是在5～6。由表6-17的pH值监测可知，试1区因加入了一定量的磷酸盐缓冲剂使pH值保持在7.6～8.4之间，大多在8左右，而大部分石油降解菌最适环境为偏碱性。空白区、对照区pH值在8.1～8.9之间，比试验区略高一些。但在此pH值范围内对此次试验影响不大，试1区加入的磷酸盐主要是为微生物的生长增加营养元素。

水在微生物降解石油污染物过程中起着重要作用(媒质和氧源)，因此，要使试验区土壤保证微生物生长繁殖的足够水量，一般保持在20%的含水率左右。在每次取样后加入约4%左右的水，表6-17数据显示试验层土壤含水量保持稳定，这为试验效果提供了基本保证。空白区为天然变化的含水量，对照区因取样后人为地翻耕可起到一定的保水作用，含水量略高于空白区，并没有对土壤石油降解起到明显促进作用。

营养元素是微生物细胞以及微生物体内生物酶的组成元素。微生物细胞的组成主要元素是C，H，O，N，P等，其中C，H来自有机物如石油污染物;氧来自水和空气及其他调控的氧源;而氮和磷及S，K，Ca，Mg，Fe等微量元素作为营养物质需要进行补充和调控。因此，我们对试验区土壤进行了N，P，S，K，Ca，Mg，Fe等元素的补充和调控，并利用当地鲜茅草(剁碎)作为添加剂补充其他生物元素和营养盐。表6-17为各区易溶盐，NH⁺₄，NO^－₃含量随试验过程的变化，从中可见试验区于8月21日补充了各种营养元素。随试验进行，微生物活动将石油和各类元素利用、降解、转化，土壤中含量逐渐减少。

3.试验过程对下层土壤的影响

从测试结果可见(表6-18)，试验1区下部土层石油含量并没有明显地增加。与对照和空白区对比还有些降低，说明试验层土壤中石油没有向下扩散或是也被降解，氮、磷等易溶盐营养物质有一小部分随水而进入下部土层，该结果为今后修复工作中对含水率和易溶营养的要求和添加方法具有特别重要的指导意义。

(二)第2试验区试验结果

在上述试验准备的基础上，按试2区试验层土壤重4.3%的比例均匀混入鸡粪与鸡粪土各50%，作为添加剂。其他条件同试1区，试验结果见表6-19，图6-12。

图6-12 试2区微生态修复土壤中石油随时间的去除率

1.微生态修复土壤中石油的去除率

通过野外上述实验，试2区在试验初期0～7d加入的优化菌液同试1区一样，也就是说需要有一个适应期，该试验适应期在7d左右。而后进入增殖期，表6-19显示在试验的第11天即适应期后期去除率就达80%以上，此次样品采集因位置不同使样品测试结果略高。但在试验至16d时去除率也达68%以上，当试验至32d时则去除率达84.3%。

2.试验土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量分析

试验区因加入了一定量的磷酸盐缓冲剂使pH值保持在7.3～8.1，而大部分石油降解菌最适环境为偏碱性，基本保证了微生物的正常生长。空白区、对照区pH值在8.1～8.9之间，比试验区高一些，但此pH值范围对试验影响不大。

试验层土壤含水量保持稳定，一般保持在20%左右，在每次取样后加入约4%的水，调控的含水率促进了细菌的降解，基本保证了试验效果。空白区为天然变化的含水率，对照区因每次取样后人为地翻耕可起到一定的保水作用，含水量略高于空白区。

表6-20为各区TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随试验过程的变化，反映出随试验进程微生物活动将石油和各类元素利用、降解、转化的过程。

表6-20 试2区土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随时间变化测试结果

3.试验过程对下层土壤的影响

表6-21是试验完成后对试2区及对照、空白区下部不同深度进行了石油，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量测试。从测试结果可见试2区试验层的下部土层石油含量并没有明显地增加，与对照和空白区对比相差不多。说明试验层土壤中石油没有向下扩散或是也被降解，从pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量也可看出不同于对照区和空白区，也就是说氮、磷等易溶盐营养物质一部分随水而进入下部土层，但不影响试验结果。

表6-21 试验后各区下部土壤中石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随深度变化测试结果

(三)第3试验区

在试验区准备的基础上，按试验层土壤重1.4%的比例均匀混入谷糠、黍糠各50%的混合物，作为添加剂。其他条件同试1区，试验结果见表6-22，图6-13。

表6-22 第3试区土壤中石油含量随时间变化测试结果

注:石油去除率计算以0d的石油含量为初始浓度(1886.0mg/kg)计算。

图6-13 试3区微生态修复土壤中石油随时间的去除率

1.微生态修复土壤中石油的去除率

通过野外现场修复试验，可以认识和了解到地质微生态技术，在土壤石油污染原位修复是有效的。试3区在试验初期第3天加入的优化菌液已发挥作用，也就是说室内优化的原位土壤中的细菌应用于试3区时，适应期较短，在试3区适应期为1～2d，而后进入增殖期。试验的第3天即适应期后去除率就达62%以上，但第7天数据出现异常。在试验至11d时去除率为76%以上，当试验至21d时则去除率达80.62%，32d时为77.29%，11d后平均去除率为77.22%。试验结果显示第11天以后细菌进入稳定期，土壤中石油降解率减慢且相对稳定。

2.土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量分析

表6-23 试3区土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随时间变化测试结果

3.试验过程对下层土壤的影响

表6-24是试验完成后对试验各区下部不同深度进行了石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量测试，从测试结果可见试验区试验层的下部土层石油含量略有增加。与对照和空白区对比增高的量并不是很大，说明试验层土壤中石油向下有部分的扩散。

表6-24 试验后试3区与下部土壤中石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随深度变化测试结果

(四)第4试验区

在上述试验区准备的基础上，按试验区试验层土壤重2.5%的比例均匀混入麦麸，作为添加剂。其他条件同试1区，试验结果见表6-25。

1.微生态修复土壤中石油的去除率

由表6-25，图6-14可知:试验区在试验初期0～7d加入的优化菌液并没有发挥作用，在试验的第11天即适应期后5d去除率就达70%以上，试验至26d时最大去除率达88.11%，但从去除率看数据有些不太稳定，在69.52%～88.11%之间波动。其原因一是土壤石油含量不均，其次细菌作用、营养成分、添加剂的均匀程度等影响了数据的稳定性。但总的来说效果是显著的，平均去除率可达78.15%。

表6-25 试4区土壤中石油含量随时间变化测试结果

注:石油去除率计算以3d，7d的试验区平均石油含量为初始浓度计算;0d的数据可能取样不均等所至略去。

图6-14 试4区微生态修复土壤中石油随时间的去除率

2.土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量分析

试验区pH值保持在6.6～9.0之间，大多在8以上，造成pH值降为6.6的原因，是添加剂刚刚加入后细菌发酵初期大量产酸造成。随后细菌的生长产碱则使环境变为偏碱性。

试验层土壤含水量基本保持稳定，一般在20%以上。实验对氨氮也进行了调控(表6-26)。

表6-26 试4区土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随时间变化测试结果

3.试验过程对下层土壤的影响

从表6-27可见试验区试验层的下部土层石油含量增加很少，与对照和空白区对比只是浅层略高，说明试验层土壤中石油没有向下扩散或是也被降解。从pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量也可看出有别于对照区和空白区，也就是说氮、磷等易溶盐营养物质有一小部分随水而进入下部土层。

表6-27 试验后试4区下部土壤中石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随深度变化测试结果

(五)第5试验区

在试验区准备的基础上，将放大培养的菌液按试5区试验层重量的3%均匀接入试验区，随后按培养基成分比例调控氮、磷、钙、镁、硫、铁等营养液均匀加入，用当地地下水调控试验土层含水量在20%左右。在一定时间间隔取样，测试结果见表6-28、图6-15。

表6-28 试5区土壤中石油含量随时间变化测试结果

注:石油去除率计算以0d，7d的试验区平均石油含量为初始浓度计算;3d的数据可能取样不均等所至略去。

1.微生态修复土壤中石油的去除率

试5区的试验初期0～7d加入的优化菌液也没有发挥作用，也需要有一个适应期，该适应期也在7d左右，而后进入增殖期。在试验的第11天即适应期后5d去除率就达84.6%以上，试验至26d时最大去除率达88.99%，但从去除率看数据有些不太稳定，在64.84%～88.99%之间不等。该试验区未加添加剂，也未覆盖塑料薄膜，但去除效果仍较好，且平均去除率可达82.51%，说明调控措施也可行。

图6-15 试5区微生态修复土壤中石油随时间的去除率

2.土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量分析

试5区pH值保持在7.7～8.5之间，大多在8以上，造成pH值降为7.7的原因，是刚刚添加磷酸盐类使其产生缓冲效果造成土壤pH值趋于中性。随后细菌的生长产碱和环境的作用则使环境变为偏碱性。水和氨氮含量调控稳定(表6-29)。

表6-29 试5区土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随时间变化测试结果

3.试验过程对下层土壤的影响

从表6-30可见试5区试验层的下部土层石油含量有所增加但较少，与对照和空白区对比高，说明试验层土壤中石油向下有些扩散。从pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量也可看出有别于对照区和空白区，也就是说氮、磷等易溶盐营养物质也有一小部分随水而进入下部土层，就其原因是该区在整个试验过程中未加盖塑料薄膜，中间几次降水量较大使污染物及营养物质向下运移。

(六)第6试验小区试验结果

在试验区准备的基础上，培养的菌液按试6区试验层土重的3%均匀接入试6区，随后按培养基成分比例调控氮、磷、钙、镁、硫、铁等营养液均匀加入，用当地地下水调控试验土层含水量在20%左右。在试验区覆盖塑料薄膜用于保温、保湿、防雨等，在一定时间间隔取样，样品测试结果见表6-31，图6-16。

表6-30 试验后试5区下部土壤中石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随深度变化测试结果

1.微生态修复土壤中石油的去除率

试6区适应期也在7d左右，试验初期0～7d加入的优化菌液也是没有发挥作用。而后进入增殖期。在试验的第11天即适应期后5d去除率为90%以上，试验至32d时则去除率达81.88%，平均去除率为87.21%。

表6-31 试6区土壤中石油含量随时间变化测试结果

注:石油去除率计算以0d，7d的试验区平均石油含量为初始浓度计算;3d的数据可能取样不均等所至略去。

图6-16 试6区微生态修复土壤中石油随时间的去除率

2.土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量分析

由表6-32的pH值监测可知，试6区pH值保持在7.6～8.4之间，大多在8以上，造成pH值降为7.6的原因，也是在刚添加磷酸盐类后使其产生缓冲效果造成土壤pH值趋于中性。随后细菌的生长产碱和环境的作用则使环境变为偏碱性。

表6-32 试6区土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随时间变化测试结果

3.试验过程对下层土壤的影响

从测试结果可见(表6-33)试6区试验层的下部土层石油含量有所增加但较少，与试5区相比也少一些，因该试区做了覆盖塑料薄膜，减少了降水的影响，未加添加物也是原因之一。与对照和空白区相比高一些，说明试验层土壤中石油向下有些扩散。

表6-33 试验后试6区下部土壤中石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随深度变化测试结果

(七)对照区、空白区试验结果

在试验区准备的基础上，对照区只加原油，不加任何其他试验材料，而后翻耕多次使之混合均匀。空白区不加任何其他试验材料也不翻动。该两区与其他试区同时在一定时间间隔取样，取样方法与试验区相同:以梅花状取5个不同点的同一深度土样(15cm)，而后充分混合后4分法取样测试。测试成分为石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量等。试验期完成后分别对各区试验层下部分层取样。取样结果见表6-34～6-36。

表6-34 对照区土壤中石油含量随时间变化测试结果单位:mg·kg^－1

表6-35 对照、空白区土壤pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随时间变化测试结果

表6-36 试验后对照、空白区下部土壤中石油含量，pH值，含水率(w)，TDS，NH⁺₄，NO^－₃含量随深度变化测试结果

通过野外原位试验得出在试验期内，对照区土壤的石油含量变化不大，除去两个异常低值(基本在10%左右，最大为13.3%)。显示出在自然条件下短时间内土壤中石油降解是缓慢的，16d，21d的测试数据可能土壤中含量不均所致，也反映了土壤物质成分的不均一性和复杂性。空白区反映了在没有加任何物质情况下土壤中的石油含量，但在试验后期因试验区和对照区与空白区相邻又加之降雨和人为取样污染了该区，造成含量有所增加。其他成分的变化基本是在天然条件下随降水的变化而变的。

四、试验讨论与结论

1.土壤中石油的去除率

从表6-37可见，大部分试验区在试验初期0～7d加入的优化菌液并没有发挥作用，也就是说室内优化的菌液应用于野外时，需要有一个适应期或是细菌的延滞期(lagphase)，本次试验大部分试区的适应期基本在7d左右。而后进入增殖期也是对数期(logarithmic phase)，表6-37显示在试验的第11天即适应期后去除率就达40%以上。只有试3区的试验有点区别，该区细菌的适应期较短，为3～4d。从整个试验过程和测试结果看，试验效果显著，但有些数据因采样位置和土壤不均匀性使测试结果偏低或偏高。但在试验至16d时去除率也达68%以上，当然每个试区因试验条件不同结果有些差别。总体来看，每个试区最大去除率均在80%以上。而对照区土壤中的石油含量变化不大，除去两个异常低值基本在10%左右，表明在自然条件下短时间内土壤中石油降解是缓慢的，16、21d的测试数据可能显示土壤中含量不均所致，也反映了土壤物质成分的不均一性和复杂性。空白区反映了在没有加任何物质情况下土壤中的石油含量，但在试验后期因试验区和对照区与空白区相邻又加之降雨和人为取样污染了该区，造成含量有所增加。

表6-37 杏子川油田杏2采油井场原位微生态修复土壤中石油随时间的降解率单位:%

2.微生态修复技术的控制因素

微生态修复技术是充分优化利用原位微生物菌群辅以物理和化学方法并与地质环境相结合的，以微观效应改变宏观环境的原位修复技术。应用该技术的关键是微生物和地质环境的相互结合、相互依存、相互作用和调控。调控因素主要有温度、水、氧气、营养元素、地质环境的改善等，用于促进元素的转化，降解有毒、