表皮生长因子用elisa还是western blot检测好

2025-02-24 21:50:58

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回答1：

目的：制备高特异性、高亲和力的抗表皮生长因子单克隆抗体，制备抗表皮生长因子多克隆抗体，利用商品化的基因重组表皮生长因子标准品及酶标二抗等试剂，建立符合临床检测要求的表皮生长因子ELISA检测方法，并对EGF的临床应用价值作初步探讨。方法：1、利用已有冻存的EGF杂交瘤细胞株，经复苏传代至细胞生长良好后，ELISA检测上清液抗体的滴度。采用体内诱生法制备单克隆抗体腹水。采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，吸取少量溶液做5或10倍稀释并用紫外分光光度法测定蛋白含量，采用A280nm和A260nm光吸收差法测定，用WesternBlot鉴定单克隆抗体的特异性并测定单抗的亲和常数。 2、以纯化的rhEGF重组蛋白为免疫原免疫新西兰大白兔，获得抗rhEGF多克隆抗体，采用饱和硫酸铵法对抗血清进行纯化，ELISA及WesternBlot方法检测制备的抗血清的效价和特异性。利用商品化的EGF标准品和酶标抗体建立EGF的间接竞争酶联免疫吸附法。 3、以制备的抗EGF单克隆抗体和多克隆抗体，以及商品化的rhEGF标准品和HRP标记的羊抗兔酶标二抗，建立单抗-多抗间接夹心ELISA法检测表皮生长因子。 4、收集慢性肝炎、肝硬化和常见肿瘤(肺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌)病人手术前(术前2～3天)及手术后(术后10～15天)的血清样本，同时收集正常体检者的血清样本，用建立的检测方法对所获得的样本进行检测以证实所建方法的可靠性。对EGF检测作为肿瘤辅助诊断及疗效判断指标的价值作初步研究。结果：1、冻存的EGF杂交瘤细胞株复苏传代经培养扩增后采用腹水诱生法制备了大量单克隆抗体，经辛酸-饱和硫酸铵法纯化单克隆抗体，抗体的蛋白含量为6.50mg/ml，SDS-PAGE鉴定纯度可达90％以上，WesternBlot鉴定McAb具有良好的特异性；间接ELISA检测McAb的腹水效价为2×10-6，亲和常数为2.4×10-10mol/L。 2、获得的抗EGF多抗血清用ELISA方法检测，抗体效价达到1∶32000，WesternBlot鉴定表明该抗体可有效识别商品化的rhEGF蛋白。以rhEGF为包被抗原，表皮生长因子为竞争的抗原，两者与一定量的抗EGF多抗反应。实验结果表明，理想的包被抗原浓度为1μg/ml，抗EGF多抗工作浓度为1∶100000，酶标二抗工作浓度为1∶8000，可测最适范围为0.5ng/ml-32ng/ml，标准曲线的批内和批间变异系数分别为1.63％和4.36％。得到回归方程y=-0.1281Ln(x)+0.8116，相关系数r2=0.9938。 3、应用获得的抗rhEGF单克隆抗体和多克隆抗体，建立表皮生长因子的单抗-多抗间接夹心ELISA检测法。该法的最适可测范围为0.125～8ng/ml，回归方程为y=0.8056x-0.2987，相关系数R2=0.9971，批内变异系数4.75％～7.50％，批间变异系数为7.49％～12.92％，回收率为91.4％～95.2％。质控品检测的相对误差＜10％，相对标准差(RSD)＜15％。

回答2：

western blot和ELISA的基本原理是一样的，都是免疫结合反应的原理。差别主要是技术方法，免疫结合的模式，检测的目的等

western blot需要先电泳后转膜，然后免疫结合，虽然操作复杂但不需要很高级的仪器设备
ELISA没有这么复杂的操作，但是需要酶标仪这样比较贵的仪器

western blot的免疫模式基本是抗原结合抗体，抗体结合二抗酶
ELISA模式更加不固定一些，可以是抗原抗体二抗酶，也可以是抗原抗体抗原酶，或者抗体抗原抗体酶等等

western blot更偏向于定性的检测，定量也只能是通过比较的半定量，误差可能很大
ELISA既可以定性也能非常精确的定量

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