连接反应产物，是否可以直接做PCR模板？要不要先灭活其中的T4连接酶？

连接产物可以用来直接作为PCR的模板，我做过。不放心的话可以65度20分钟处理一下。
我觉得这样做是可行的。但是最终的PCR产物可能会有各种非特异性扩增，切胶回收时要注意片段大小是否正确

这样做实际上是不可行的，效率会很低。我以前也想你一样试过。
原因：粘性末端相连的机会不大，而且要6个同时都相连，机会是呈指数级别下降的。而且如果直接做PCR的话，那些没有连接或者部分连接的片段十个极大的干扰。
2个方案：既然酶切位点独特，建议把A和F修改为直接可以和质粒互补的末端，连接后直接克隆。比做PCR的可能性要大。
或者先做AB， CD， EF连接，克隆后再做两次ABCD+EF连接。

博凌科为-为你解答：理论上讲，你可以这样做，甚至可以直接做PCR而不用连接。这个其实和多对分段克隆基因的原理一样，都是让前一对引物的下游引物，和后一对引物的上游引物有一段互补序列。这样所获得的PCR片段就是前一段的末端和后一段的前端就会有互补序列。但是问题是，这样的前后序列一般有15个碱基左右的互补序列，而酶切位点的互补序列太短。这个需要你把PCR反应的退火温度降低。来保证碱基互补。

你这个想法理论上讲是可行的，但是实际操作起来就会存在很大的困难。小片段连接比较难做。根据你的叙述，最后连接好的片段约为200bp左右。我建议你把这200bp的片段分成4段，即1，2，3，4段，合成有15个碱基互补的4条引物，1与2，3与4做一次重叠延伸，然后以1与2，3与4的产物为模板，1和4为引物在做一次重叠延伸PCR，这样就ok了，速度会很快的。分成4段是因为引物合成碱基个数小于60个的，按正常收费，这样节约成本。