第二代DNA测序技术的应用展望

最好是论文或是报告什么的！！

2025-02-27 08:33:21

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回答1：

第二代测序技术

--以Illumina/Solexa Genome Analyzer 为例

1.概述

DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。

2.基本原理

Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成变测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

3.操作流程

1）测序文库的构建（Library Construction）

首先准备基因组DNA（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以便在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。

2）锚定桥接（Surface Attachment and Bridge Amplification）

Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。
3）预扩增（Denaturation and Complete Amplification）
添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

4）单碱基延伸测序（Single Base Extension and Sequencing）

在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA 聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的软件是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。

5）数据分析（Data Analyzing）

这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。

（注：图片引自Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387–402）

4.讨论

目前Solexa测序的读长能达到75bp，这个大小比传统的Sanger测序要短得多，也比Applied Biosystems 公司的SOLID测序要短，但是Solexa测序的优势是能够获得海量的数据，并且价格低廉，按相同的数据量来算，Solexa测序要比其他测序技术便宜很多。75bp的长度肯定是不适合直接用来分析的，测序得到的reads需要拼接之后才能有实际的用途，这就要求有强大的生物信息学分析能力作为支撑。

和传统的测序技术相比，Solexa测序的错误率也相对较高，并且测序错误倾向于分布在read后面的碱基中，如何区分测序错误和真正的DNA多态性也是一个大问题。

尽管新一代测序技术还不尽如人意，但是它还是有着广泛的应用。目前一些模式生物的全基因组重测序、非模式生物的全基因组测序以及一些生物的转录组测序都采用了新一代测序技术，比如说前不久刚发表的熊猫的全基因组(Ruiqian Li et al,2009)测序就是用Solexa测序技术完成的。

5.参考文献

(1)Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387–402

(2)Jay Shendure, Hanlee Ji (2008) Next-generation DNA sequencing. nature biotechnology 6:1135-1145

(3)Stephan C Schuster (2008) Next-generation sequencing transforms today’s biology. Nature Methods 5:16-18

(4)Zhou DG, Zhao QG, Fu CG et al (2008) The Next Generation Sequencing and its Effect on the Rice Molecular Design Breeding. Molecular Plant Breeding 6: 619-630

回答2：

没有最好，只有更好

回答3：

http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n10/full/nbt1486.html

http://shiyan.ebioe.com/DNAsequencing01.htm

http://www.85922222.com/zsyy/qyjs/201004/4091.html

http://www.genomics.purdue.edu/~ltl/data-web/2nd_gen_sequencing.pdf

回答4：

第二代DNA测序技术：由捕捉新合成末端的标记来确定DNA序列

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