色谱法又称色谱分析、色谱分析法、色层分析法、层析法,是一种分离和分析方法,在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配,以流动相对固定相中的混合物进行洗脱,混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动,最终达到分离的效果。色谱法起源于20世纪初,1950年代之后飞速发展,并发展出一个独立的三级学科——色谱学。历史上曾经先后有两位化学家因为在色谱领域的突出贡献而获得诺贝尔化学奖,此外色谱分析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。原理色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程,不同的物质在两相之间的分配会不同,这使其随流动相运动速度各不相同,随着流动相的运动,混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制,又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。基本技术和方法根据流动相的不同,色谱技术可以分为液相色谱和气相色谱。色谱法常见的方法有:柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。柱色谱法是最原始的色谱方法,这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中,将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端,以流动相洗脱。常见的洗脱方式有两种,一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱,一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法,一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液,另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带,以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离,包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法,这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层,用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端,之后将点样端浸入流动相中,依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作简单,被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。气相色谱是机械化程度很高的色谱方法,气相色谱系统由气源、色谱柱和柱箱、检测器和记录器等部分组成。气源负责提供色谱分析所需要的载气,即流动相,载气需要经过纯化和恒压的处理。气相色谱的色谱柱一般直径很细长度很长,根据结构可以分为填充柱和毛细管柱两种,填充柱比较短粗,直径在5毫米左右,长度在2-4米之间,外壳材质一般为不锈钢,内部填充固定相填料;毛细管柱由玻璃或石英制成,内径不超过0.5毫米,长度在数十米到一百米之间,柱内或者填充填料或者图布液相的固定相。柱箱是保护色谱柱和控制柱温度的装置,在气相色谱中,柱温常常会对分离效果产生很大影响,程序性温度控制常常是达到分离效果所必须的,因此柱箱扮演了非常重要的角色。检测器是气相色谱带给色谱分析法的新装置,在经典的柱色谱和薄层色谱中,对样品的分离和检测是分别进行的,而气相色谱则实现了分离与检测的结合,随着技术的进步,气相色谱的检测器已经有超过30种不同的类型。记录器是记录色谱信号的装置,早期的气相色谱使用记录纸和记录器进行记录,现在记录工作都已经依靠计算机完成,并能对数据进行实时的化学计量学处理。气相色谱被广泛应用于小分子量复杂组分物质的定量分析。高效液相色谱 (HPLC)是目前应用最多的色谱分析方法,高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成,其整体组成类似于气相色谱,但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳;进样系统要求进样便利切换严密;由于液体流动相粘度远远高于气体,为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗,长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛,几乎遍及定量定性分析的各个领域。分类按固定相的形式
1. 柱色谱法(column chromatography ):
固定相装在柱中 , 试样沿着一个方向移动而进行分离。
包括 填充柱色谱法:固定相填充满玻璃管和金属管中
开管柱色谱法:固定相固定在细管内壁(毛细管柱色谱法)2.平板色谱法 (planer chromatography ):
固定相呈平面状的色谱法。
包括 纸色谱法: 以吸附水分的滤纸作固定相;
薄层色谱法:以涂敷在玻璃板上的吸附剂作固定相。
纸上层析法就是用被层析液在纸的一端1cm出划线,然后此端浸入层析液,层析液顺着纸向上扩散过程中,使被层析液中成分随之不同程度的扩散,从而达到分离被层析液目的的方法。
注意:1,纸要先层析液蒸汽中预饱和2,层析时,层析液不可没过划线。操作时,先要点样。取少量试样,用水或易挥发的有机溶剂(如乙醇、丙酮等)使它完全溶解,配制成浓度约1%的溶液。在滤纸上距一端约2~3厘米处用铅笔画一记号作为原点,用毛细管或微量注射针筒吸取少量试样溶液在原点滴一小滴,每滴试样体积为0.002~0.02毫升,控制点样直径在0.3~0.5厘米左右。晾干后再在原点处重复上述操作1~2次。将已点样并晾干的滤纸悬挂在层析槽内,并使滤纸下端(有点样一端)边缘浸入展开剂液面下约0.5~1厘米,但点样的位置必须在展开剂液面之上,将层析槽盖上。借助于毛细现象,展开剂带动试样中各组分以不同速度沿滤纸逐渐向上移动