为什么用两种不同的限制酶切目的基因和运载体，就能防止运载体本身、基因本身连起来？

两种不同的限制性内切酶识别并切割的序列是不同的，也就是两种酶分别切割了基因和载体时，产生了两个切口，这两个切口不是粘性末端，不能互补配对，所以不可能连接在一起，如果用一种酶来切那么这样基因中或者是载体上就会有相同的粘性末端，这样基因本身除了切下来的那段之外，剩下的部分在连接酶作用下相同的粘性末端就会配对连接，同样载体也会继续连接成环，基因和载体连在一一起也有，而且首尾的顺序也有两种，连接体系跑电泳结果会有4个条带，至少是4种，而且就算那个连接后的片段大小符合你要求的那段纯化后也有一部分是不能表达的。哪四种就不用写了，你肯定知道的，不能表达的那部分就是顺序不对的，这就是同种酶切连接的缺陷性。

两个不同的限制性核酸内切酶识别并切割的顺序是不同的，是，这两种酶分别切割的基因和载体，以产生的两个切口，这两个切口不粘性末端，不能互补配对，所以不可能连接在一起，与切断，然后该基因或载体的酶将具有相同的粘性末端，从而使该基因本身除了切片，和下连接酶相同的粘性末端，将配对的连接的剩余部分，在相同的载波如果要求将继续连接成一个环，一个基因和连接到一个共同的载体，和顺序2种运行电泳结果的连接系统，将有四个条带，至少4种，甚至纯化的片段大小与连接部分无法表达的。什么是四不写，你肯定知道，不能表达这部分是不正确的顺序，这是同一种消化的连接缺陷。

同种限制酶切割基因上的同一个位点，产生相同的粘性末端或平末端，所以可以连起来，不同限制酶切割位点不一样，所以连不起来。

还有一个疑问，如果是两个载体或是两个目的基因相连，也是两种酶切位点只是顺序相反了，那不是有三种了吗，怎么可能不用筛选？