临床分子生物学检验

核酸分离与纯化

核酸分离提取的原则

1、选择原则，一是保证提取核酸一级结构的完整性，二是尽量排除其他分子的污染

2、保持核酸结构的完整性，应尽量减少破坏核酸的有害因素，尽量简化操作步骤。

技术路线的设计

1、核酸的释放，有物理法和化学法，化学法又分为溶胞法（应用最多最广泛）与干燥法

2、核酸的分离纯化，须去除三方面的杂质：非核酸大分子物质，不需要的核酸分子，分离纯化过程中新加入的有机溶剂和金属离子等。

3、核酸的浓缩、沉淀和洗涤

浓缩：若溶液中DNA含量低且容积较大，不易进行乙醇沉淀时，可用固体聚乙二醇吸水浓缩法或丁醇抽提浓缩法浓缩DNA。

沉淀与洗涤：有机溶液沉淀核酸主要是利用核酸可与纳钾等阳离子形成盐，屏蔽了带负电的磷酸基团，使核酸分子聚集在一起而不溶于有机溶剂；盐类可使核酸沉淀，但往往含有少量共沉淀的盐，此时可经70-75%的乙醇洗涤而除去。

核酸的鉴定

首先是含量的鉴定

1、紫外分光光度法：核酸分子中的碱基对波长260nm的紫外光有强烈吸收作用（最大吸收峰），1微克DNA钠盐的吸光度之为0.02，也就是A260=1时双链DNA含量为50μg/ml，单链DNA/RNA含量为40μg/ml，单链寡核苷酸的含量为33μg/ml。适用于浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。

2、荧光光度法，以荧光染料嵌入碱基平面，则核酸在紫外线的激发下发出荧光，且荧光强度积分与核酸含量成正比，有三个特点：灵敏度高；受RNA，ssDNA和其他物质的干扰小；对分子生物学中的常用酶无抑制作用。

其次是纯度鉴定

1、紫外分光光度法：最常用，核酸在260nm处有最大吸收峰，蛋白质则在280nm处；盐和小分子在230nm处，酚在270nm处，这个差别可区分到底是什么污染；

纯DNA的A260/A280=1.8，若高出说明RNA污染，若低于则说明残余蛋白质；

A260/A280=2.0为高质量RNA的标志（1.8-2.1都可以） A230/A260=0.4-0.5，若升高则说明有残余盐。

2、荧光光度法

利用荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，核酸在紫外线的激发下发出橙红色荧光，作为荧光染料示踪。可鉴定DNA制品有无RNA干扰，反之亦可。

RNA变性电泳后有特征性的三条带，原核生物为23S、16S、5S的rRNA条带，真核生物则由28S、18S的rRNA和5S、5.8S的rRNA和tRNA；（mRNA代表基因转录水平，行使模版功能）

还有完整鉴定性：

以溴化乙锭为示踪染料的核酸琼脂糖凝胶电泳结果可用于判断核酸完整性

1、完整无降解或降解很少的总RNA电泳图，除具特征性三条带外，三条带的荧光强度应为一特定比值

2、降解系数大的核酸条带相对分子质量大，电泳迁移率低，溴化乙锭嵌入核酸中的数量也增多，荧光强度高；反之~

3、一般28S或23SRNA的荧光强度约为18S或16S的2倍，否则提示有RNA降解，若在加样槽附近有条带，则DNA有污染。

保存：

DNA：原则是减少DNA脱氨基，抑制DNA酶、减少DNA分子的各种反应、避免微生物污染

一般将DNA保存于pH8.0的TE缓冲溶液中，可减少DNA脱氨/抑制DNA酶，加少量氯仿可抑制细菌污染；在零下70度可保存5年+

RNA：主要是抑制RNA酶

以焦炭酸二乙酯水溶解RNA，或在RNA溶液中加入RNasin（RNA酶阻抑蛋白）等RNA酶抑制剂，可延长保存时间；另外将RNA以沉淀形式保存于70%乙醇溶液或去离子甲酰胺溶液中，可于零下20度长期保存。