不可以，只能用同一种限制酶来切割质粒和目的基因。原因是，用同一种限制酶来切割，可以产生相同的黏性未端，如果用两种限制酶切割，产生的黏性未端一般不相同。
用一种来切的话你插入的目的基因没法确定方向 因为两头都可以连上用两种来切的话就可以保证你插入序列的方向性
