两者主要是细胞壁的结构不同.
革兰氏阳性菌的细胞壁,是一层厚而致密的肽聚糖和磷壁酸组成.肽聚糖的肽链之间通过5个甘氨酸交联着.
革兰氏阴性菌的细胞壁则是多层结构,从内到外依次是：薄薄的肽聚糖层,脂蛋白层/周质层,磷脂层和脂多糖层.革兰氏阴性菌的肽聚糖结构也和革兰氏阳性菌的有所不同,肽链是直接交联在一起的.
细胞壁结构的不同,决定了两类细菌革兰氏染色结果(阳性紫色阴性红色)和对不同类抗生素敏感性的不同.
革兰氏是一种鉴别细菌染色方法，革兰氏阳性细菌细胞壁中的（肽聚糖）含量丰富层数多细胞壁厚，而革兰氏阴性菌细胞壁中（肽聚糖）含量较少细胞壁相对来说较革兰氏阳性细菌要薄。所以在染色后阳性菌比阴性菌着色要深。医学便以区分2种细菌。
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